TB基因分型試劑盒HV-3說明書

TB Typing Kit HV-3

TB基因分型試劑盒HV-3說明書

目錄號：K2571

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組分說明

應(yīng)用                    Cat. No.        K2571-20       K2571-50

                        Kit Size             20          50

                         VNTR3820         400  μl       1 ml

高分辨3位點(diǎn)VNTR檢測   VNTR4120        400  μl        1 ml

                         VNTR3232         400  μl       1 ml

DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) I        MarkerⅠ          120  μl      300  μl

DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn) II        MarkerⅡ         100  μl      250  μl

其它相關(guān)產(chǎn)品  YJ2570 TB基因分型試劑盒 VNTR-9

產(chǎn)品簡介

    本試劑盒是以分子流行病學(xué)新的研究進(jìn)展1）為基礎(chǔ)，經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用結(jié)核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態(tài)性進(jìn)行基因型分型區(qū)分臨                                                床菌株，是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)和監(jiān)測結(jié)核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌VNTR分型系統(tǒng)相比，這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強(qiáng)的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國用戶的需求。

    通過對各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進(jìn)行精心優(yōu)化，使得本產(chǎn)品具有很強(qiáng)的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號強(qiáng)度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現(xiàn)率，使實(shí)驗(yàn)操作更加簡便、快捷的同時，提高了檢測成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學(xué)穩(wěn)定性良好，能有效抵抗反復(fù)凍融（10次）和較長時間（一周）的室溫環(huán)境，更好地適應(yīng)了用戶檢測工作中的靈活性需求。

     本試劑盒是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 K2570）的配套產(chǎn)品。對 VNTR-9 試劑盒鑒定為成簇或相同菌株的樣本，如有必要，可使用本產(chǎn)品做更精細(xì)的進(jìn)一步分型鑒定。本產(chǎn)品中的 3 個高分辨率檢測位點(diǎn) VNTR3820，VNTR4120和VNTR3232 與 VNTR-9 中的 9 個檢測位點(diǎn)結(jié)合使用可將檢測的分辨率指數(shù)（Hunter-Gaston index，HGI)提升至 0.993                                                                                                                1）

參考文獻(xiàn)

1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium

    tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)

2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping

    Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)

3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype

    strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.

注意事項(xiàng)

1.  本產(chǎn)品是 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9（貨號 K2570）的配套產(chǎn)品。待測菌株應(yīng)先經(jīng)過 VNTR-9 分型檢測，再使用  本產(chǎn)品檢測。且本產(chǎn)品的檢測結(jié)果應(yīng)與 VNTR-9 的檢測結(jié)果進(jìn)行整合分析。

2.  為避免污染，建議制備生物時與配制 PCR Mix 在不同的地點(diǎn)內(nèi)進(jìn)行，并使用不同的移液器。

3.  在樣本 DNA 的收集，抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)注意作好標(biāo)記，同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。

4.  常用試劑和耗材在實(shí)驗(yàn)前需高壓滅菌。

5.  每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用。可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求一次性分裝為不同的量，避免反復(fù)凍融。

6.  為避免打開反應(yīng)管時，反應(yīng)液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。

7.  吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。

8.  實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1×TE  緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設(shè)備和凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應(yīng)管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。

操作步驟

1.  DNA 模板制備：

1.1  從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本，重懸于 100 ul TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。

1.2  滅活后的菌株拿出 P3 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行如下操作：

     100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時注意避免 EP 管蓋子爆開，避免讓水進(jìn)入管中)，立即置于冰上 2 分鐘，12,000 rpm (~13,400×g)離心 10 分鐘，取上清置于另一無菌 EP 管中，做上標(biāo)記，-20°C 保存。

2 .  檢測程序：

2.1  取出 TB 基因分型試劑盒 HV-3，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，然后 12,000 rpm (~13,400×g)離心5秒，使蓋上的液體回落到管內(nèi)。                                                                                                    2.2  三位點(diǎn) VNTR 分型：對于 12 位點(diǎn)結(jié)果相同的菌株需進(jìn)一步進(jìn)行 VNTR 分型，即增加以下 4 個位點(diǎn)進(jìn)行比較。

1）PCR 擴(kuò)增：反應(yīng)體系為 20 μl。

   在每個 PCR 管里分別加入 19 μl VNTR3820、VNTR4120、VNTR3232 的  PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。

2）擴(kuò)增條件：

a .  VNTR3820：

                           步驟          溫度            時間

                         預(yù)變性         95℃           10 min

                         變性            94℃         30 s

                        退火             58℃         30 s      30 個循環(huán)

                        延伸             72℃         90 s

                        終延伸           72℃        7 min

b.  VNTR3232、VNTR4120：

                        步驟             溫度            時間

                     預(yù)變性             95℃              10 min

                    變性               94℃              30 s

                    退火                64℃           30 s   30 個循環(huán)

                   延伸               72℃                90 s

                   終延伸             72℃               7 min

3）制膠、電泳：

   a：注意事項(xiàng)：  

   重要！每次實(shí)驗(yàn)需要設(shè)置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。

   關(guān)鍵！本實(shí)驗(yàn)是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎(chǔ)來判讀 VNTR 位點(diǎn)基因型，因此，為了使結(jié)果準(zhǔn)確，在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

   a-1：制膠所用梳子為 18 孔。

   a-2：凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形，影響結(jié)果判讀，舍棄不用，或者在其中一個孔點(diǎn)上陰性對照。剩余 16 孔分為 12 個樣本，3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點(diǎn)樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，

         6，  M，7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，數(shù)字代表樣本，M 代表 DNA Marker。

   a-3：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行首次電泳并使用 Marker I 時，凝膠濃度為 1%，電壓為 150V，時間為 100-120 分鐘。

   a-4：如果擴(kuò)增產(chǎn)物片段過大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時，凝膠濃度為 0.8%，電壓 150V，時間為150 分鐘。

   b：制膠以及電泳過程：

   使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

   配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤制膠，每塊膠為 80 ml。

   b-1：稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補(bǔ)入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。

   b-2：待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫?zé)岬哪z澆灌入 12×12 cm 膠盤。

   b-3：待凝膠*凝結(jié)（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，沒過膠面 1-2 mm。

   b-4：上樣電泳：每塊膠中加入 12 個樣本（最邊上的孔不加樣），每個孔中加入 3-5 μl PCR 產(chǎn)物，同時每塊膠上加三個 5 μl DNA MarkerⅠ。電壓 150V，電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟是各位點(diǎn)最終讀數(shù)是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵，需要統(tǒng)一按照此標(biāo)準(zhǔn)操作。

   b-5：部分位點(diǎn)在臨床菌株中存在擴(kuò)增產(chǎn)物大于 1000 bp 的情況，對這些擴(kuò)增產(chǎn)物再利用 0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，同時加入 DNA Marker II 作為條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鐘。

4）結(jié)果顯示：

MarkerⅠ  

MarkerⅡ

5）結(jié)果分析：

   a.  如果不同菌株的 3 個高變位點(diǎn)基因型也相同，可確定為成簇菌株；

   b.  如果高變位點(diǎn)讀數(shù)高度相似，即只有 1-2 個高變位點(diǎn)有差別，需結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)鑒定是否為成簇菌株；

   c.  如果 3 個高變位點(diǎn)基因型都不一致，鑒定為單一菌株。

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