一步法快速WB（HRP）試劑盒（兔）說明書

One Step Western Kit HRP (Rabbit)

目錄號：K2029

保存條件：2-8℃保存，避免冷凍。

 組分說明

 Cat. No.             K2029                K2029A         K2029B

Kit Size               10                            2             50

封閉液        125 ml                     3 0ml        500 ml

抗體反應液     HRP（兔）1 ml      2 0 0μl     5×1 ml

抗體稀釋液     125 ml                       3 0m l       500 ml

漂洗液（10×） 125 ml                      3 0 m l        500 ml

 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及其他用途產品簡介

　　一步法快速WB試劑盒（兔）是上海研謹生物近期推出的Western Blot檢測試劑盒，能夠在1小時左右得到高質量的Western Blot結果，且操作簡便、檢測靈敏度高、背景低、不需再加入二抗、系統穩定性強。常規的Western Blot間接法檢測過程（封閉、一抗結合和二抗結合）需要較長的時間，實驗流程復雜且需要多步條件優化。膠上的蛋白轉移到載體膜上后，使用試劑盒中的封閉液孵育5 min，再用抗體反應液處理后的一抗孵育載體膜，經洗滌三次（每次5 min）后，即可進行發光或顯色檢測。本試劑盒針對目的蛋白一抗為兔來源的實驗系統使用。

注意事項

1. 客戶需自己準備兔來源的一抗。

2. 使用封閉液、抗體稀釋液（兔）、漂洗液之前請充分混勻。

3. 漂洗液如在2-8℃保存時出現沉淀，請恢復到室溫，把沉淀溶解后正常使用，1×漂

洗液可在室溫保存一個月。

4. 建議轉膜完成后用麗春紅等試劑染色，并把膜上多余部分剪去以增加試劑的使用效

率。

5. 一抗和抗體反應液HRP（兔）需要通過預實驗來確定最*+佳的稀釋用量。

6. 抗體反應液HRP（兔）、抗體稀釋液和抗體用量可根據膜的大小按比例放大或減少。

7. 加入一抗的抗體稀釋液可以回收重復使用一次。特異性及親和力低的抗體不建議重

復使用。回收后抗體如在1-2天內使用放置在2-8℃，長期保存請在-20℃凍存，避

免多次反復凍融。

8. 如果存在較高背景的情況，請調整抗體的用量，并增加洗膜次數。

9. 試劑盒內所有試劑請于2-8℃保存，避免凍融。

操作步驟

本產品適用于轉膜完成后的封閉及抗體孵育步驟，以5 cm×8 cm 膜為例：

1．漂洗液準備：取10 ml 10×漂洗液用蒸餾水稀釋至100 ml待用。每次洗膜用8-10 ml。

2．轉膜完成后，將膜浸沒到10 ml封閉液中，室溫封閉5分鐘。

3．倒掉封閉液，加入8-10 ml 1×漂洗液，于搖床上用較大速度漂洗1分鐘。

4．洗膜的同時可準備抗體孵育液：取抗體反應液HRP（兔）100 μl到EP管中，加入兔

源一抗3-10 μg，槍頭吸打至充分混勻，室溫孵育5分鐘。

5．將混勻的抗體與反應液HRP（兔）混合液加入到10 ml 抗體稀釋液中，充分混勻。

    注意：1）一抗的用量也可根據抗體的稀釋度來進行調整。以抗體的最終稀釋度1:1000為例，取100 µl抗體反應液HRP（兔）到EP管中，加入10 µl一抗，加入到10 ml 抗體稀釋液中，充分混勻，室溫孵育5分鐘。

   2）如果膜面積較小，可按比例減少抗體、反應液及稀釋液的用量。

6．步驟3中，洗膜完成后，倒掉漂洗液，將混合一抗、反應液及稀釋液的抗體孵育液

加到膜上（確保孵育液*浸沒膜表面），在搖床上以60rpm左右的速度室溫孵育40分鐘。

7．棄去（回收）抗體稀釋液，用1×漂洗液漂洗3-5次，每次3分鐘。

8．進行后續檢測。建議采用ECL試劑盒（K0049）進行檢測。

  常見問題解答                

問  題：信號太弱或者看不到條帶

可 能 原因：

a蛋白上樣量太少

b蛋白轉膜效率太低

c一抗親和力較低

解決方案:

a進行SDS-PAGE電泳時加大上樣量。

b優化轉膜時間或者電流，確保轉膜時膜與膠之間沒有氣泡。

c增加膜在溶液（含有mixture 1的WB-2）中的孵育時間。

 增加抗體濃度可以增加信號。

d 對于低親和力抗體來說，減少洗膜時間可以增加信號。     

由每次10min，減少到每次5min可以增加信號。                 

問  題：背景偏高

可 能 原因：

a一抗使用過量

b一抗有非特異性結合或者與封閉試劑有交叉反應

c洗膜時間太短

d曝光顯影時間過長

e容器或者試劑被污染

解決方案:

A減少一抗的使用量，相應的減少WB-1用量。

B使用pretreat A-b（M01052）。 客戶還可以使用Quick Block Optimization kit 來找到最*+佳的封閉試劑。

C增加洗滌的步驟可以進一步的降低背景。

D減少曝光時間。如果信號和背景都高，可以等待一段時間，等背景信號減弱后，再進行曝  光。

e每次洗滌的時候使用清潔的容器。帶手套，使用清潔的鑷子處理膜。

實驗代做服務：