Protein A瓊脂糖凝膠說明書

Protein A-Agarose

Cat. No.  K0011    

保存：2-8℃

組分說明

         Cat.No.         K0011         K0011A

         Volume           1 ml            5 ml

產(chǎn)品簡介

    本產(chǎn)品可從血清，腹水，細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞抽提物中分離和純化多種哺乳動(dòng)物丌同亞型的抗體或包含抗體Fc 片段的基因工程重組蛋白。具有高IgG 結(jié)合特異性，高流速，低 Protein A-Agarose 脫落等特點(diǎn)。

注意事項(xiàng)

1. 凝膠從冷室或冰箱中取出后在室溫下緩慢振搖恢復(fù)到室溫， 裝柱，避免產(chǎn)生氣泡影響柱效。

2. 裝柱時(shí)盡可能維持凝膠長徑比為5：3-2：1，長徑比過大將導(dǎo)致洗脫峰拖尾，洗脫體積增大；長徑比過小將導(dǎo)致樣品不填料接觸時(shí)間短，吸附丌充分，填料吸附蛋白量小 。

3. 若上樣液中抗體濃度過高應(yīng)使用平衡緩沖液稀釋至 1-2mg/ml，以免上樣濃度過高影響柱效。

4. 可以采用降低上樣時(shí)的流速來增加樣品不填料接觸時(shí)間從而提高純化抗體量。

5. 凝膠用低pH緩沖液洗脫時(shí)間應(yīng)盡可能短，洗脫后用中性緩沖液盡快中和至 pH中性，以延長親和介質(zhì)的使用壽命。

6. 洗脫后，應(yīng)立刻用如中和緩沖液將收集到的抗體溶液中和到中性（pH7.4 左右），以利于維持抗體的生物活性，避免抗 體失活。

7. 填料使用后應(yīng)用 0.1M 檸檬酸鈉緩沖液（pH3.0）做再生處理，長期采用的洗脫條件將縮短親和介質(zhì)的使用壽命。

8. 其它柱再生處理方法：本產(chǎn)品使用10 次以上后先用20%乙醇洗 5 個(gè)柱床體積，再用 70%乙醇洗脫5-10 個(gè)柱床體積，可洗脫脂類和疏水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，避免使親和介質(zhì)的載量下降、干擾親和介質(zhì)的應(yīng)用效果。

操作步驟

I 緩沖液的準(zhǔn)備

1. 平衡緩沖液：純化不同動(dòng)物和不同亞型抗體時(shí)所用平衡緩沖液是丌同的，部分參照如下  

抗體 平衡緩沖液成分人  IgG1、人   IgG2、小鼠     IgG2a、小鼠    IgG2b   20 mM   磷酸鹽緩沖液，300 mM NaCl，pH 7.4-8.5

人  IgG3、人   IgG4、小鼠    IgG1、大鼠     IgG3    50 mM Tris-Cl，3M NaCl，pH7.8-8.5

2. 洗脫緩沖液：0.1M         檸檬酸鈉緩沖液，pH4.0。

3. 再生緩沖液：1M NaCl。

4. 中和緩沖液：1M Tris-Cl，pH9.0。

注意：

 1）對于某些純化載量較少的抗體，可適當(dāng)提高需平衡緩沖液中的鹽濃度              （zui高可達(dá)3M）和pH 值 （zui高可達(dá)8.2），以提高抗體和介質(zhì)的吸附力。但是有時(shí)高pH會(huì)使雜蛋白吸附增加，使用者應(yīng)根據(jù)實(shí)際使用狀況適當(dāng)調(diào)節(jié)。   

   2）以上緩沖液使用前均需0.45μm濾膜過濾。

II 樣品的準(zhǔn)備

1. 樣品用平衡緩沖液稀釋5-10倍，以保證樣品液的成分及pH和平衡緩沖液接近。若上樣體積過大，可以采取調(diào)節(jié)上樣液pH和鹽濃度的方式，使樣品的pH和電導(dǎo)不平衡液接近，并使樣品中的緩沖體系不平衡緩沖液相同。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)液中大量的血清蛋白會(huì)對親和層析造成一定的干擾，去血清處理或稀釋樣品將提高純化抗體收率。

   注意：樣品在上柱前需0.45μm微孔濾膜過濾。

III 操作步驟

1. 填料裝柱后，用超純水流洗3-5個(gè)柱床體積以洗掉乙醇，用平衡緩沖液流洗5-10個(gè)柱床體積平衡柱子。

2. 將樣品上柱，上樣流速60cm/h。

3. 平衡緩沖液再洗5-10個(gè)柱床體積，直至基線平穩(wěn)。

4. 洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰，用中和緩沖液將洗脫收集樣品中和到中性。

5. 立即用5-10個(gè)柱床體積平衡緩沖液平衡柱子到中性。

6. 再生緩沖液流洗3-5個(gè)柱床體積。先后用純水、20%乙醇分別流洗 3-5 個(gè)柱床體積。柱子置于4~8℃保存。

   注意：操作中如果沒有實(shí)時(shí)的蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，收集洗脫峰時(shí)可以分階段收集到多個(gè)管中，后根據(jù)測定結(jié)果重新調(diào)整收集方式。