在應(yīng)用ELISA時(shí)，首先要清楚下面內(nèi)容：1，是檢測(cè)抗體還是抗原？2，檢測(cè)的結(jié)果是定性還是定量？3，是否需要檢測(cè)特異抗體的類型？4，所用抗體/單克隆抗體的親和力怎樣？

（1）檢測(cè)抗原  zui常用于檢測(cè)抗原的方法是非競(jìng)爭(zhēng)性的雙抗體夾心法，其次是競(jìng)爭(zhēng)法。但競(jìng)爭(zhēng)法在具體實(shí)驗(yàn)中有些困難，特別是檢測(cè)微生物的抗原，因?yàn)樾枰獦?biāo)記抗原，這對(duì)于某些抗原是很難做到的，甚至是不可能的。另外在競(jìng)爭(zhēng)法中，酶標(biāo)記的抗原與標(biāo)本直接混合在一起，許多標(biāo)本中含有酶抑制劑或蛋白A樣物質(zhì)，可影響ELISA的結(jié)果。

（2）檢測(cè)抗體  檢測(cè)抗體種類常用的方法是檢測(cè)抗體種類的捕獲法，這個(gè)方法常用于檢測(cè)特異性IgG、IgA和IgM.。這個(gè)方法的*步是捕獲所需要檢測(cè)的一個(gè)種類的抗體，接下來是檢測(cè)捕獲的抗體是否是特異性抗原的抗體。間接ELISA在檢測(cè)IgG時(shí)比較簡(jiǎn)單，但不適用于檢測(cè)其他種類的抗體，因?yàn)檠逯腥绻刑禺?/span>IgG存在將與IgM或IgA等競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原。

競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體有兩種方法：一種是將標(biāo)記的抗體和標(biāo)本同時(shí)加入反應(yīng)孔內(nèi)，但標(biāo)記的抗體和標(biāo)本中的抗體必須是結(jié)合抗原的不同決定簇；另一種是先加標(biāo)本，沖洗后再加標(biāo)記的抗體。競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)抗體比間接法容易判斷結(jié)果，并且比較敏感和特異。不論選擇哪種方法，ELISA都包括6個(gè)步驟：1，抗原或抗體吸附于固相；2.加標(biāo)本和試劑；3，孵育和沖洗；4，加酶標(biāo)抗原或抗體；5，加適當(dāng)?shù)牡孜铮?/span>6，檢測(cè)和分析結(jié)果。

雖然ELISA法在理論上十分簡(jiǎn)單，但每一步都有要注意的事項(xiàng)。不論是新設(shè)計(jì)的ELISA還是沿用其他ELISA方法都有以下幾方面技術(shù)要點(diǎn)：固相載體的選擇和試劑的制備，反反應(yīng)條件和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。